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北京華新康信也有transnetyx實驗試劑銷售，對transnetyx組織常見問題做了解答如下：

家/Transnetyx 組織常見問題解答 | Transnetyx 組織

Soussou WV, Yoon GJ, Brinton RD, Berger TW (2007) 在表面處理的多電極陣列上培養的海馬神經元的神經元網絡形態和電生理學。IEEE 跨生物醫學工程。54:1309-1320。 下午：17605362

Brewer GJ, Cotman CW (1989) 海馬神經元在低密度限定培養基中的存活和生長：夾心培養技術或低氧的優勢。大腦研究 494：65-74。下午：2765923。

預涂層 PDL 培養皿

1.你能推薦任何品牌的預涂層組織培養瓶或制備組織培養瓶用于原代神經元生長的方法嗎？

Transnetyx已經確定，細胞培養塑料或玻璃上的聚-D-賴氨酸涂層在涂層后明顯開始失去效力。鍍膜玻璃條在 14 天后失效，鍍膜塑料在 10 天后失效。 Transnetyx懷疑一些預涂板的效果令人滿意，但Transnetyx的經驗是，其中一些會導致原代神經元的粘附和存活不良。因此，Transnetyx建議您在一周內或上述幾天后涂抹您自己的基材并使用它們。

2.你們銷售預涂層培養皿嗎？

是的，Transnetyx銷售 PDL 涂層燒瓶、孔板和玻片。Transnetyx在一夜之間涂上這些涂層，并在第二天將它們運送到隔夜交貨。Transnetyx建議您在一周內使用這些。 

新鮮紙巾

1.你們提供什么年齡的紙巾？ 

Transnetyx的標準組織是胚胎第 18 天或懷孕媽媽（3-4 個月大）的成人組織。所有其他組織年齡可用于特殊訂單，交貨時間為 2-3 周。

Wolburg H, Neuhaus J, Kniesel U, Krauss B, Schmid EM, Ocalan M, Farrell C, Risau W (1994) 調節血腦屏障內皮細胞的緊密連接結構。組織培養、第二信使和共培養的星形膠質細胞的影響。J 細胞科學 107（第 5 部分）：1347-1357。 下午：1692329 

Risau W, Engelhardt B, Wekerle H (1990) 血腦屏障的免疫功能：不完整的表現

體外大鼠腦微血管內皮的蛋白質（自身）抗原。細胞生物學雜志 110:1757-1766。 PM:7929640 有關從脊髓分離運動神經元的更多信息 M. Das、JW Rumsey、N. Bhargava、M. Stancescu 和 JJ Hickman。確定的長期體外神經肌肉接頭組織工程模型。生物材料 31 (18):4880-4888, 2010.  PM:20346499

2.你保證每瓶皮層和海馬有多少神經元？

保證的神經元數量為海馬體 100 萬個或皮層神經元 200 萬個。其他組織類型的數字不同。

3 . 根據 NIH 批準的協議獲得動物大腦和脊髓組織有什么保證？

Transnetyx的動物協議 #233-08-013 已于 2020 年 4 月 7 日獲得南伊利諾伊大學醫學院實驗動物護理和使用委員會的批準。  

對于 NIH 撥款，脊椎動物部分：

保證編號為 A-3209-01。

F. 脊椎動物

用于原代培養的海馬、皮質和其他腦和脊髓神經元將從胚胎或出生后早期大鼠或小鼠的腦中獲得。用氟烷麻醉后將解剖大腦。將用于大鼠的心臟。小鼠將在麻醉下被送上斷頭臺或斷頸。這些方法與美國獸醫協會專家組的建議一致。

通過從動物身上分離神經元，可以研究比整個動物研究更多的實驗變量，從而減少對動物的需求。大鼠和小鼠的大腦是所有動物大腦中研究得好的。

平均住房需求估計為 2 天，足以讓嚙齒動物從運輸創傷中恢復。動物將由獲得 AALAC 認證的 SIUSM 實驗室動物醫學中心負責照料，并在獲得 DACLAM 認證的 Helen Valentine、DVM、MS 的指導下擁有 10 名員工

用氟烷麻醉后將解剖大腦。將用于大鼠的心臟。小鼠將在麻醉下被送上斷頭臺或斷頸。這些方法與美國獸醫協會專家組的建議一致。因此，這些程序將動物的使用限制在進行具有科學價值的研究中不可避免的范圍內，并將動物的不適、痛苦和疼痛降至低。

 冷凍細胞

1.你們提供冷凍細胞系嗎？

目前，Transnetyx不提供冷凍細胞，也沒有冷凍細胞的方案。您可以請求快速凍結作為自定義選項，但需要支付額外的處理費。

解離

2.海馬或皮層細胞的活力是否取決于解離的方法？你更喜歡機械解離還是酶解？

是的，使用木瓜蛋白酶可獲得更高的可行產量（參見 J Neurosci Meth 71:143），但表面蛋白的消化是不可避免的。對于短期（少于 4 天），這是一個問題。從長遠來看，它可能并不重要。使用火拋光的 9 英寸玻璃移液管可獲得更高的存活率，使用藍色塑料移液管可獲得更低的能見度。對于 E18 組織，Transnetyx使用機械來提高速度和簡單性。

3.您是否使用酶來制備皮質培養物？

為了獲得更高的產量，Transnetyx使用了 2mg/mL 的 木瓜蛋白酶溶液， 稀釋在沒有 B27® 的 Hibernate® E-Ca 中。該溶液應在 30 o C 水浴中孵育 10 分鐘。不應向該溶液中添加其他化學物質，例如 EDTA、巰基乙醇或半胱氨酸-HCl。請參閱Transnetyx的 原代神經元細胞培養方案 了解更多信息。

4.為什么推薦 Hibernate® E-Ca without B27® 以實現與木瓜蛋白酶的最佳解離？

鈣促進粘附。因此，去除鈣會促進神經元的解離。為了提供細胞粘附蛋白作為木瓜蛋白酶的主要底物，B27® 被省略，因此 B27® 中的蛋白質不會競爭底物。

文化

1. 原代細胞會增殖嗎？如果有，你能傳代多少次？

原代細胞不會增殖，不應傳代。如果傳代，只有 30% 的細胞存活，細胞不能進行第二次傳代。

2.你知道每瓶組織提供多少星形膠質細胞嗎？

星形膠質細胞的數量是細胞數量的 20%。培養神經元培養物時，使用不含血清 (NbActiv1™) 的培養基培養星形膠質細胞含量低于 2% 的培養物。這在沒有 AraC 的情況下抑制了膠質細胞的生長。在培養星形膠質細胞時，可使用含有血清（NbAstro™ - Neurobasal®/Horse Serum/GlutaMAX™）的培養基在 1.5 至 2 周內使星形膠質細胞匯合。

3.我應該何時添加 AraC 作為星形膠質細胞的有絲分裂抑制劑？

在Transnetyx推薦的 Neurobasal®/B27®/GlutaMAX™ 培養基中，您根本不需要添加 AraC。培養基不會像血清那樣人為地刺激星形膠質細胞的增殖。

4.星形膠質細胞會增殖嗎？如果有，它們可以傳代多少次？ 

星形膠質細胞確實增殖并且可以傳代。Transnetyx的 E18 星形膠質細胞最多可成功傳代 4-5 次。

5.海馬神經元何時表現出興奮性毒性？

乙酰膽堿在Transnetyx所知道的任何年齡都沒有毒性。

從 E18 海馬培養 7 天開始，谷氨酸的毒性最大。皮層神經元可能提前 1 或 2 天。

6.我的培養物被污染了。一開始它們看起來很好，但現在介質是混濁和黃色的，有許多 1-3 um 長的暗相。

至少有 5 種可能的污染源（假設您的培養箱中的其他培養物沒有受到污染并且培養箱底部的加濕水是清澈的）：

培養容器本身可能是污染源。為了排除這種情況，將新鮮過濾的培養基添加到另一個培養容器中。如果介質變黃或混濁，則容器已被污染。

粘合基材。這很常見。您可以將新鮮過濾的培養基放在準備好的基材上，以尋找這種污染源。

培養基本身或其添加劑之一（例如谷氨酸）。這很常見。請務必在您的培養基的未涂層孔和Transnetyx提供的孔中進行單獨的測試。

看似隨機或低水平的污染可能來自于向開放文化的方向說話甚至呼吸。此外，無菌罩和培養箱之間的空氣不是無菌的，并且大多數培養容器沒有密封。如果從通風罩到培養箱的距離很遠，您可以將培養物放入已用 70% 乙醇沖洗過的塑料食品容器中。

組織。雖然Transnetyx對Transnetyx提供的培養基進行無菌測試，但組織本身無法測試。如果您能提供證據證明您的紙巾按時送達并在 4 o  C 下保存直到使用，并且排除了上述 4 種可能性，請致電Transnetyx進行一次性更換。通常，Transnetyx的經驗是，您的樣品是Transnetyx本周所有發貨中被污染的樣品，因此請理解Transnetyx需要進行上述測試。

7.我想知道你能否給我建議，我需要多少個細胞，才能獲得足夠的蛋白質來進行幾次蛋白質印跡？即，多少個細胞等于 20-50 ug 蛋白質？

根據 Patel 和 Brewer (2003) 的說法，每 18,000 個培養一周的細胞含有大約 6 ug 的蛋白質。因此，3000 個細胞/ug 蛋白質。需要大約 50 g 蛋白質的蛋白質印跡提取物需要大約 150,000 個細胞。

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